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細(xì)胞培養(yǎng)的具體步驟和要求以及注意事項(xiàng)

更新時(shí)間:2022-01-28  |  點(diǎn)擊率:1498

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)現(xiàn),使得很多研究不必局限于在動(dòng)物或人體內(nèi)進(jìn)行,試驗(yàn)環(huán)境更為簡單,目的更為明確,如:細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)的基礎(chǔ)研究;細(xì)胞與細(xì)胞相互作用;細(xì)胞與環(huán)境間的相互作用;遺傳學(xué)與細(xì)胞轉(zhuǎn)化;細(xì)胞產(chǎn)物和分泌等等。

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展很大程度上是由醫(yī)學(xué)研究的需求而促進(jìn)的,如:抗病毒疫苗的研究,腫瘤發(fā)生及治療的研究;基因重組技術(shù);單克隆抗體技術(shù);組織工程;染色體分析等體外檢測技術(shù),以及體外輔助生殖技術(shù)。

科研實(shí)驗(yàn)中,細(xì)胞的體外培養(yǎng)一直是一個(gè)重要環(huán)節(jié)。細(xì)胞要養(yǎng)好,就要用好血清,如Ausbian®特級胎牛血清,它適合各種細(xì)胞培養(yǎng),尤其適合難養(yǎng)細(xì)胞,如:干細(xì)胞、肝細(xì)胞,神經(jīng)細(xì)胞,原代培養(yǎng)、細(xì)胞融合、轉(zhuǎn)染細(xì)胞等。

細(xì)胞培養(yǎng)的具體步驟

一、細(xì)胞復(fù)蘇

將凍存細(xì)胞從液氮中取出后,在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動(dòng)促進(jìn)其融化。移人15ml離心管中,加入10ml預(yù)熱的DMEM*培養(yǎng)基,輕輕吹勻,離心,2000rpmX2min,棄上清液。

加入10ml DMEM培養(yǎng)基清洗,棄上清液。加入10ml DMEM*培養(yǎng)基,輕輕吹打,接種于10cm盤中,在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

二、細(xì)胞傳代

細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時(shí).去培養(yǎng)基,10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶,放人細(xì)胞培養(yǎng)箱3min。加人1ml DMEM*培養(yǎng)基終止胰酶消化,轉(zhuǎn)移至15ml離心管。

加入10ml PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤,轉(zhuǎn)移至15ml離心管,2000rpmX2min,棄上清液。再加入10ml PBS(經(jīng)高壓滅菌,保存于40C),吹勻,吸取10微升進(jìn)行計(jì)數(shù),按照1×106/盤接種,在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

三、細(xì)胞凍存

細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時(shí),去培養(yǎng)基,10ml PBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶,放人細(xì)胞培養(yǎng)箱3min。加入lmlDMEM*培養(yǎng)基終止胰酶消化,轉(zhuǎn)移至15ml離心管。加入10ml PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤,轉(zhuǎn)移至15ml離心管,2000rpmX2min,棄上清液。

加入lml凍存液(90%血清,10%DMSO),放入凍存盒內(nèi)(盒內(nèi)有異丙醇,以保證溫度降低的速度),立即放入一80℃冰箱內(nèi),過夜,第二天放入液氮中,可以保存至少兩年,如不放人液氮,可以保存三個(gè)月。

凍存液的配制:70%的*培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加,邊滴邊搖。

注意事項(xiàng)

(1)進(jìn)入細(xì)胞間開始細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),必須嚴(yán)格按照下列步驟操作:

①確定所有的細(xì)胞操作用的溶液和耗材都已經(jīng)消毒并檢測沒有問題,不確定的溶液和耗材請勿使用,除非特殊情況,不要借用別人的溶液。

②確定衣服的袖口已經(jīng)卷起或者白大褂的袖口已經(jīng)扎緊。

③確定酒精燈內(nèi)的酒精量,需要的話及時(shí)進(jìn)行補(bǔ)充。

④確定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。為了方便單手開啟瓶蓋,實(shí)驗(yàn)開始前可以把所有瓶蓋旋松。

⑤盡量不要直接傾倒溶液,除非瓶口沒有被燒壞。如果傾倒失敗,溶液粘在瓶口,請用噴過75%酒精的紙巾仔細(xì)清潔瓶口周圍(不要接觸到瓶口)后在火焰上簡單燒灼。

⑥操作時(shí)如果不能肯定所用的耗材是潔凈的,必須及時(shí)更換。

⑦實(shí)驗(yàn)完畢及時(shí)收拾,保持工作區(qū)域清潔整齊,最后用75%酒精清潔臺(tái)面。

(2)細(xì)胞污染的預(yù)防

①實(shí)驗(yàn)用品防止污染。細(xì)胞培養(yǎng)所用試劑、耗材、器材的清洗、消毒要*,各種溶液滅菌要仔細(xì),并在無菌實(shí)驗(yàn)檢測陰性后才能使用。操作室及剩余的無菌器材要定期清潔、消毒、滅菌。

②操作過程防止污染。

③穿著容易起靜電或吸附灰塵的衣物必須更換為白大褂后才能進(jìn)入細(xì)胞間。

④實(shí)驗(yàn)開始前需要確定戴的手套沒有問題,只要接觸過生物安全柜之外的物品,必須及時(shí)對手套進(jìn)行消毒。

⑤進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)間后關(guān)好門,坐下來盡量少走動(dòng)以免影響生物安全柜的風(fēng)簾。工作開始前要先用75%酒精棉球擦手和瓶蓋。事先要嚴(yán)格檢查所用的器材、溶液和細(xì)胞,不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無菌室內(nèi),更不能隨便使用,以免造成大規(guī)模污染。

⑥細(xì)胞操作時(shí)動(dòng)作要輕,必須在火焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開瓶口,并將瓶口放在火焰周圍簡單轉(zhuǎn)動(dòng)燒灼,注意不要讓火焰把塑料瓶口燒化。

⑦實(shí)驗(yàn)操作時(shí)生物安全柜的隔板要盡可能放低,盡量減少談話,打噴嚏或咳嗽時(shí)絕對不能對著工作區(qū),以免造成不必要的污染。

⑧瓶蓋應(yīng)當(dāng)?shù)狗旁谶h(yuǎn)離自己的地方,以避免瓶蓋被誤操作所污染。

⑨不要從敞開的容器口上方經(jīng)過,以避免衣服上掉落不明物體對細(xì)胞的污染。

⑩實(shí)驗(yàn)操作時(shí)要注意及時(shí)更換巴斯德吸管、移液槍槍頭和移液管,切勿一根管子做到底。一旦發(fā)現(xiàn)接觸了非潔凈或者無法確定潔凈的物品必須直接丟棄。實(shí)驗(yàn)完畢應(yīng)及時(shí)收拾,保持實(shí)驗(yàn)室清潔整齊,最后用75%酒精清潔臺(tái)面。

(3)防止細(xì)胞交叉污染

①在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí),所用器具要嚴(yán)格區(qū)分,最好作上標(biāo)記便于辨別。按順序進(jìn)行操作,一次只處理一種細(xì)胞,多種細(xì)胞多種操作一起進(jìn)行時(shí)易發(fā)生t昆亂。

②在進(jìn)行換液或傳代操作時(shí),粘有細(xì)胞的移液槍頭和移液管不要觸及試劑瓶瓶口,以免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)基中污染其他細(xì)胞。

③所有細(xì)胞一旦購置,或從別處引入,或自己建立,必須及時(shí)保種凍存,一旦發(fā)生污染可重新復(fù)蘇細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)。



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